|
|
Stanovení vybraných chemoterapeutik v extracelulárních vesikulech pomocí ICP hmotnostní spektrometrie
Kožnarová, Simona ; Hložková, Michaela (oponent) ; Vašinová Galiová, Michaela (vedoucí práce)
Extracelulární vesikuly jsou poměrně nově objeveným způsobem mezibuněčné komunikace. Problematika těchto membránou ohraničených váčků je stále značně neprobádaná, a to především na poli jejich role při nádorových onemocněních. Cílem této pilotní studie bylo pokusit se detekovat platinu ve vesikulech pomocí ICP-MS. Pro tento účel byly použity vzorky z buněčných linií nádorů ovarií, které byly vystaveny platinovým derivátům (typ chemoterapeutika). Tato metoda se ukázala jako schopná nejen platinu detekovat, ale i spolehlivě stanovit její koncentraci. Množství platiny ve vesikulech se pohybovalo kolem 1–2 % z celkově dodanému množství platiny do systému. Výsledky se lišily dle použitého platinového derivátu, buněčné linie a počtu buněk, kterými byly vesikuly uvolňovány. Nejvíce platiny bylo stanoveno ve vesikulech linie SK-OV-3, která je na tuto léčbu přirozeně rezistentní, a to u všech platinových derivátů. Využití ICP-MS je tedy vhodné i pro další výzkum této problematiky.
|
|
|
Large Extracellular Vesicles in Cell Culture and Blood: Role in Prion Transmission and Detection by Flow Cytometry
Soukup, Jakub
Priony (PrP) jsou hlavní příčinou neurodegenerativních onemocnění jako je ovčí klusavka, bovinní spongiformní encefalopatie, chronické strádání jelenovité zvěře a lidská Creutzdfeld- Jacobova choroba. Přestože se buněčný PrP (PrPC ) účastní mnoha buněčných procesů, jeho přesná funkce není dosud známá. Onemocnění vzniká akumulací patologické formy PrP (PrPTSE ), která vzniká přímým kontaktem PrPTSE a PrPC . PrP je ukotvený v membráně pomocní GPI a může být přenášen mezi buňkami kontaktem, tzv. "tunnelling nanotubes" nebo extracelulárními vezikuly (EV). Frakce EV se dělí na exosomy, mikrovezikuly a apoptotická tělíska rozdílnou biogenezí. PrPTSE se nachází v exosomech a mikrovezikulech, ale tyto frakce EV nikdy nebyly mezi sebou porovnány. Prvním cílem dizertační práce je porovnat obsah PrP, prion konvertující aktivitu a infektivitu v těchto frakcích EV na CAD5 a N2a-PK1 buněčných modelech infekce. Centrifugací jsme izolovali frakci velkých EV (20 000× g) a malých EV (110 000× g) z kondiciovaného média. EV jsme charakterizovali pomocí kryo-elektronové mikroskopie a western blotem s markery Alix, TSG-101, CD63, CD9 a HSP70. Kontaminace z jiných buněčných kompartmentů byla ověřena kalnexinem. Frakce EV se mezi sebou lišili obsahem β-1 integrinu. Malé EV mají sníženou a velké EV mají zvýšenou hladinu...
|
|
|
Epigenetická dědivost ovlivňující chovaní následujících generací a její zvratnost během ontogeneze
Freisingerová, Kateřina ; Landová, Eva (vedoucí práce) ; Švorcová, Jana (oponent)
Cílem této práce je zaměřit se na možné mechanismy přenosu změn, které jsou podmíněny epigenetickými modifikacemi, které by mohly ovlivnit specifické chování a fenotyp u potomků. Dědivost může být vedena jak přes maternální, tak paternální linii. Lze ji rozdělit do dvou odlišných skupin přenosu, a to intragenerační a transgenerační. Tato práce se zaměřuje na možné mechanismy transgeneračního přenosu. Epigenetické mechanismy vedoucí k navození změn fenotypu organismu spočívají v ovlivnění regulace čtení DNA, a to přes několik úrovní, jako je methylace DNA, chemické úpravy, acetylace a jiné posttranslační modifikace, a hlavně nekódující RNA molekuly. Dnes je již známo nespočet studií, které se zabývají vysvětlením těchto molekulárních procesů zprostředkovaných enviromentálními vlivy. Známé jsou mateřská péče, chemikálie nebo traumatické zážitky. Existují příklady traumatických enviromentálních vlivů, u kterých lze pozorovat fyziologické změny regulace HPA osy s následnou změnou v expresi genů pro tzv. depresivní a úzkostlivý fenotyp. Většina experimentů se zaměřením na epigenetický přenos je prováděna převážně na hlodavčích modelech. Existují ale i studie, pozorující tento fenomén u lidí. Ty jsou často zkoumány z pohledu ovlivnění přes potravní deprivace těhotných žen, farmakologických látek (některá...
|
|
|
Large Extracellular Vesicles in Cell Culture and Blood: Role in Prion Transmission and Detection by Flow Cytometry
Soukup, Jakub ; Holada, Karel (vedoucí práce) ; Šebestová Janoušková, Olga (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
Priony (PrP) jsou hlavní příčinou neurodegenerativních onemocnění jako je ovčí klusavka, bovinní spongiformní encefalopatie, chronické strádání jelenovité zvěře a lidská Creutzdfeld- Jacobova choroba. Přestože se buněčný PrP (PrPC ) účastní mnoha buněčných procesů, jeho přesná funkce není dosud známá. Onemocnění vzniká akumulací patologické formy PrP (PrPTSE ), která vzniká přímým kontaktem PrPTSE a PrPC . PrP je ukotvený v membráně pomocní GPI a může být přenášen mezi buňkami kontaktem, tzv. "tunnelling nanotubes" nebo extracelulárními vezikuly (EV). Frakce EV se dělí na exosomy, mikrovezikuly a apoptotická tělíska rozdílnou biogenezí. PrPTSE se nachází v exosomech a mikrovezikulech, ale tyto frakce EV nikdy nebyly mezi sebou porovnány. Prvním cílem dizertační práce je porovnat obsah PrP, prion konvertující aktivitu a infektivitu v těchto frakcích EV na CAD5 a N2a-PK1 buněčných modelech infekce. Centrifugací jsme izolovali frakci velkých EV (20 000× g) a malých EV (110 000× g) z kondiciovaného média. EV jsme charakterizovali pomocí kryo-elektronové mikroskopie a western blotem s markery Alix, TSG-101, CD63, CD9 a HSP70. Kontaminace z jiných buněčných kompartmentů byla ověřena kalnexinem. Frakce EV se mezi sebou lišili obsahem β-1 integrinu. Malé EV mají sníženou a velké EV mají zvýšenou hladinu...
|
|
|
Extracelulární váčky a střední T antigen myšího polyomaviru
Kropáček, Václav ; Šroller, Vojtěch (vedoucí práce) ; Brázdová, Andrea (oponent)
Tato práce se soustřeďuje na střední tumorový antigen (MT Ag) myšího polyomaviru (MPyV), potenciální důsledky jeho sekrece extracelulárními váčky (EVs) a jeho vliv na buněčnou signalizaci. MT Ag je membránově asociovaný protein schopný navodit nádorovou transformaci díky interferenci s buněčnou signální transdukcí, zejména aberantní aktivací MAP kinázové dráhy. V první části práce jsme proto navázali na předchozí pozorování provedená v rámci naší skupiny, ukazující, že střední T antigen může být sekretovaný z buněk extracelulárními váčky. Zajímalo nás, zda MT Ag může přispívat k transformaci recipientních buněk. Provedli jsme 2 typy izolace extracelulárních váčků z linií myších fibroblastů stabilně exprimujících střední T antigen (3T6MT) a prokázali jsme jeho přítomnost. Provedli jsme charakterizaci izolovaných EVs detekcí exosomálních markerů a kryo-elektronovou mikroskopií. Následně jsme vystavili recipientní buňky myších fibroblastů (3T6) izolovaným EVs a za pomoci průtokové cytometrie zjišťovali, zda došlo k internalizaci MT Ag. Zároveň jsme se pokusili detekovat, zda došlo u buněk vystavených EVs ke zvýšení hladiny fosforylace MAP kinázy Erk. Ve druhé části práce jsme se pokusili potvrdit a podrobněji analyzovat předešlé nepublikované pozorování zvýšené hladiny fosforylace jaderného faktoru...
|
|
|
Mechanismy prezentace antigenu v etiopatogenezi celiakie.
Hudec, Michael ; Černá, Marie (vedoucí práce) ; Hrdý, Jiří (oponent) ; Slavčev, Antonij (oponent)
1 ABSTRAKT Celiakie (CeD) je chronické autoimunitní onemocnění, které se rozvíjí jako odpověď imunitního systému na přítomnost lepku (glutenu) v tenkém střevě. CeD se projevuje nejen klasickými střevními příznaky: bolest břicha, obstipace nebo diarrhea, ale i celkovými méně běžnými příznaky: anémie, osteoporóza, psychiatrické poruchy či poruchy menstruačního cyklu. HLA rizikové alely predisponující ke vzniku celiakie jsou HLA-DQ2 (DQA1*05:01 / DQB1*02:01) a HLA-DQ8 (DQA1*03:01 / DQB1*03:02). Další polymorfismy asociované s celiakií ležící mimo HLA lokus (6p21.3) se nacházejí v oblastech 5q32 a 19p13, avšak s neobjasněnou souvislostí s rozvojem CeD. Glykoproteiny HLA II. třídy jsou exprimovány na buňkách prezentujících antigen (APC), mezi které patří dendritické buňky, makrofágy a B lymfocyty. Jedním z několika možných prekurzorů dendritických buněk jsou monocyty, které cirkulují v krevním řečišti. Odchylky ve frekvenci intermediárních monocytů jsou přímo asociovány s autoimunitními onemocněními, jako jsou Crohnova choroba či revmatoidní artritida. Je známo, že monocyty pacientů s CeD reagují na přítomnost glutenu prozánětlivě. Z toho lze vyvodit, že v případě CeD vzniká odpověď na gluten dříve, než aktivací T lymfocytů specifických na gluten. Konvenční způsob přímé interakce imunitních buněk je dnes...
|
|
|
Separation of exosomes from polydisperse suspension in microfluidic devices
Paříková, Anna
The work included fine-tuning the experimental methodology, writing an in-house code for exosome tracking based on a one-way\napproach, and performing a parametric study to investigate the separation potential of the microdevice as a function of channel geometry, flow rate, and viscosity. Preliminary results show that viscoelasticmicrofluidics can be used as an alternative to conventional e xosome separation techniques.
Plný tet:  PDF
|
|
|
Molecular events associated with resistance to tyrosine kinase inhibitors in leukemia cells.
Hrdinová, Tereza
Chronická myeloidní leukémie (CML) je myeloproliferativní onemocnění hematopoézy charakterizované expresí konstitutivně aktivní tyrozin kinázy BCR-ABL. Ačkoli vývoj tyrozin kinázových inhibitorů (TKI) jako je imatinib zásadním způsobem zefektivnil léčbu CML, u určité skupiny pacientů vzniká rezistence na TKI léky. Nejčastější příčinou rezistence jsou bodové mutace v genu BCR ABL1, méně pak i další na mutaci nezávislé mechanismy. Růst rezistentních CML buněk v přítomnosti TKI léků je důsledkem adaptivních změn v jejich metabolismu. Rezistence může být udržována vnějšími signály, mezi nimiž sehrávají důležitou roli exozomy, malé membránové vezikuly uvolňované (rezistentními) buňkami. Cílem této práce bylo proteomicky charakterizovat dvě buněčné linie CML (senzitivní a rezistentní na imatinib) a také exozomy, produkované rezistentními buňkami. Identifikace metabolických drah esenciálních pro růst rezistentních buněk v prostředí imatinibu umožňuje zacílit jejich metabolismus klinicky dostupnými léky, což nabízí potenciál pro jejich využití v (personalizované) léčbě. Proteomickou analýzou exozomů z rezistentních buněk lze identifikovat specifické povrchové membránové proteiny využitelné jako klinicky relevantní diagnostické markery rezistence na imatinib. Pro tyto účely byly vyvinuty a analyzovány dvě...
|
|
|
Fenotyp melanocytů za fyziologických a patologických podmínek
Strnadová, Karolína ; Lacina, Lukáš (vedoucí práce) ; Mokrý, Jaroslav (oponent) ; Balvan, Jan (oponent)
Neopomenutelnými reprezentanty buněčných populací kůže, kromě dominantních keratinocytů a fibroblastů, jsou také melanocyty. Melanocyty jsou pigmentové buňky, jejichž primární funkcí je produkce pigmentu melaninu, který je důležitý pro ochranu keratinocytů před škodlivým ultrafialovým zářením. Nadměrné vystavení tomuto záření je rizikovým faktorem pro vznik kožních nádorů včetně maligního melanomu kůže, při kterém dochází k patologické transformaci melanocytů v buňky melanomu. Předložená disertační práce pojednává o studiu melanocytů a zaměřuje se na 4 tematické okruhy spojené zejména s jejich patologiemi. V prvním tematickém okruhu je do souvislostí dána zvyšující se incidence maligního melanomu kůže se stárnutím populace. Jednou z příčin se zdá být častější výskyt prozánětlivého ladění tkání ve stárnoucím organismu. Toto ladění připravuje vhodné prostředí pro vývoj nádoru. Druhý tematický okruh se orientuje na nové přístupy, které by mohly rozšířit škálu diagnostických metod pro časnou detekci maligního melanomu. První metodicky využívá detekci prozánětlivých molekul v těle pacienta, např. v době diagnózy. Bylo zjištěno, že vyšší sérové hladiny IL-6 nebo IL-8 korelují s nepříznivou prognózou pacienta. Druhý přístup se opírá o možnosti detekce nádorových buněk a možnosti jejich odlišení od buněk...
|
|
|
miRNA analýza malých extracelulárních vezikul izolovaných z plasmy po dietní intervenci
Kratochvílová, Michala ; Koc, Michal (vedoucí práce) ; Šrámek, Jan (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo zavedení protokolu izolace malých extracelulárních vezikul (sEV) z lidské plasmy. Vzorky plasmy byly odebírány od 44 zdravých žen, které v rámci klinické studie podstoupily dietní intervenci 60 h hladovění. Tyto ženy byly na základě BMI rozděleny do skupin hubené a obézní. Z plasmy odebrané před a po dietní intervenci byly metodou precipitace pomocí polyethylenglykolu vyizolovány sEV, které byly následně charakterizovány z hlediska jejich velikosti a koncentrace ve vzorku. U hubených i obézních žen byl počet sEV v plasmě stejný a nezměnil se ani v závislosti na dietní intervenci. V důsledku 60 h hladovění došlo ke změně velikosti sEV u skupiny hubených. Dalším cílem byla analýza miRNA exprese v sEV. Obsah sEV se v expresi některých analyzovaných miRNA lišil mezi skupinou hubených a obézních žen. Rozdíly byly pozorovány konkrétně v expresi hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p a hsa-let-7b-5p. 60 h hladovění vedlo ke zvýšené expresi hsa- miR-5100 u skupiny hubených a hsa-miR-27a-3p a hsa-miR-27b-3p u skupiny obézních. Tyto změny navozené dietní intervencí ale nebyly vyhodnoceny jako statisticky významné. Hladovění tedy ani u jedné skupiny nevedlo k výrazným změnám miRNA obsahu v sEV. Odlišné miRNA exprese byly patrné pouze mezi skupinami na základě rozdílného BMI. Klíčová...
|
host ::
RSS.